Autores:jjjjjjj Paulo Cesar Naoum
Flávio Augusto Naoum

Introdução

                                                                                          As talassemias beta são mais heterogêneas do que as do tipo alfa. Caracterizam-se por uma alteração quantitativa da síntese de globinas beta e são classificadas como talassemias beta zero (ou talassemia b ⁰) quando não há síntese de globinas, e talassemias beta mais (ou talassemia b⁺) quando há alguma taxa de síntese. Consequentemente as globinas alfa, que são sintetizadas normalmente, acumulam-se nos eritrócitos, durante a eritropoiese, causando agregação e precipitação. Os precipitados, formados em quantidades variáveis, danificam a membrana e destroem prematuramente essas células provocando a anemia (figura 7.11).

   As supressões parcial e total das globinas beta, bem como das globinas delta e gama situadas no mesmo cromossomo 11, e que dão origem aos diferentes genótipos de talassemias b, d e g, estão representados na figura 7.12.

   De forma geral, os tipos mais comuns entre as talassemias beta são as heterozigoses: b^A/b⁰, b^A/b⁺ mediterrâneo, b^A/b⁺⁺ africano, b^A/b⁺ silenciosa, b^A/b⁰ com Hb A₂ normal, e b^A/b⁺ com Hb A₂ normal. As talassemias beta homozigotas correspondentes são: b⁰/b⁰, b⁺/b⁺ mediterrâneo, b⁺⁺/b⁺⁺ africano, b⁺/b⁺ silenciosa, b⁰/b⁰ com Hb A2 normal, e b⁺/b⁺ com Hb A₂ normal. A tabela 7.3 apresenta as principais características laboratoriais desses tipos de talassemias beta,nos estados de heterozigose e homozigose. A figura 7.13 representa esquematicamente as conseqüências laboratoriais da redução parcial ou total da síntese de globina beta, nas talassemias beta heterozigotas (ou menor), e nas talassemias beta homozigotas com redução parcial de síntese de globina beta (b⁺/b⁺ ou b⁰/b⁺) e redução total de globina beta (b⁰/b⁰), ambos são clinicamente caracterizados como talassemia beta maior.

   O modo de herança das talassemias, assim como de outras alterações genéticas da hemoglobina, é autossômico, e o termo dominante ou recessivo é difícil de ser aplicado, porque alguns heterozigotos apresentam claros distúrbios clínicos, ao passo que outros não. No entanto, a talassemia beta é considerada de herança autossômica recessiva, porque são necessários dois genes anormais da globina beta para produzir o fenótipo clinicamente detectável. Recentemente, no entanto, formas dominantes de talassemia beta têm sido identificadas, as quais resultam em fenótipos de talassemia intermédia para portadores de um único gene alterado.

   Com a utilização de técnicas de biologia molecular foi possível a identificação de aproximadamente 180 tipos diferentes de talassemias beta, cujas diversidades estão relacionadas com os graus de lesões no gene beta, podendo inclusive atingir os genes delta, pseudogene beta-1, os genes gama alanina e gama glicina e até o gene embrionário épsilon. A figura 7.14 representa por meio de traços pretos a intensidade de lesão por deleção sofrida pelos genes do complexo (b, d, g^A, g^G, wb₁ e e), em alguns casos bem conhecidos de talassemia beta.

   O processo fisiopatológico da talassemia beta está muito relacionado com o desequilíbrio que se verifica entre as sínteses de globina alfa e beta. Com a síntese de globina beta afetada, por diminuição parcial (b⁺) ou bloqueio total (b⁰), a relação a/b supera o valor de equilíbrio que é de 1,0. A globina alfa, que não teve sua síntese alterada, apresenta produção normal, e como não há globina beta suficiente para formar tetrâmeros a₂b₂ ocorrerá a presença de globinas alfa livres, cuja intensidade é proporcional à piora do quadro clínico do portador, seja recém-nascido, ou com idade acima de 6 meses, conforme ilustra a figura 7.15.

   Fisiologicamente o excesso de globinas (ou cadeias) alfa livres se instabiliza e se precipita sob forma de corpos de inclusão nos eritroblastos. Essa precipitação provoca situações patológicas celulares, conforme o local de sua ocorrência. Quando se dá na medula óssea, observa-se uma seqüência de fenômenos que se iniciam pela peroxidação dos lipídeos da membrana eritrocitária e geração de espécies ativadas de oxigênio, os radicais oxidantes ou radicais livres. A célula com baixa hemoglobinização é particularmente sensível a esse tipo de agressão tóxico-oxidante, pois a membrana lesada permite a perda de potássio e adenosina-tri-fosfato (ATP), tornando o eritrócito rígido, sem o poder natural da deformabilidade, e como conseqüência dificulta sua saída da medula óssea para o sangue periférico.

   Por outro lado, as células que têm maior hemoglobinização, mesmo que seja pela presença de Hb Fetal, apresentam-se com menores graus de lesões e, portanto, maior período de vida. Ainda em nível de células eritroblásticas, a precipitação de globinas alfa causa o bloqueio da síntese de DNA com conseqüente interrupção da síntese de globinas. O somatório das situações anteriormente mencionadas: precipitação de globina alfa, rigidez celular e lesão do DNA, provoca a eritropoiese ineficaz que é responsável pela situação de anemia e pelo aumento da absorção do ferro.

   Quando os eritrócitos com os corpos de inclusões compostos por globinas alfa atingem o sangue periférico, sua rigidez, associada às lesões na membrana eritrocitária, contribui para o seqüestro dessas células durante a circulação nos sinusóides esplênicos. O resultado dessa atuação fisiopatológica que se verifica nos doentes talassêmicos é a anemia hemolítica, com aumento da concentração da bilirrubina indireta e da esplenomegalia. A esplenomegalia pode resultar em hipereslenismo, pelo aumento da função do baço, levando a um processo mais abrangente de destruição das células do sangue, gerado a leucopenia e a plaquetopenia. A leucopenia pode contribuir par a instalação de infecções, constituindo-se em importante causa dos óbitos verificados em doentes com talassemia beta maior. A plaquetopenia induz, por sua vez, o derramamento de sangue nasal (epistaxes).

   As conseqüências provenientes da eritropoiese ineficaz, hemólise e hiperesplenismo resultam em anemia grave com anoxia, cardiopatias que são importantes causas de óbito na talassemia maior, hipermetabolismo com emagrecimento, febre, aumento do nível de ácido úrico e gota, e a necessidade de transfusões repetidas de sangue. Essas transfusões, que se tornam periódicas para os talassêmicos doentes, causam o acúmulo de ferro e da ferritina, podendo ocorrer hepatopatias graves por hepatite transfusional, além de doenças transmissíveis em transfusões, notadamente a AIDS e hepatite C, e esporadicamente doença de Chagas e Sífilis.

   Devido à deficiência significativa de globina beta, a formação de hemoglobina fica por conta das globinas alfa e gama, resultando a elevação percentual ou relativa da Hb Fetal. Embora, com baixa concentração corpuscular, a Hb Fetal com sua alta afinidade pelo oxigênio contribui para a anoxia tecidual. A anoxia tem efeitos maléficos ao organismo, predispondo-o às infecções, ao aparecimento de úlceras nas pernas e à interferência na secreção de eritropoietina que promove a hiperplasia eritróide. A hiperplasia eritróide causa o aumento da absorção do ferro, com seu acúmulo sob forma de ferritina. Nesse caso específico de acúmulo de ferro o doente talassêmico grave pode ter várias conseqüências patológicas desde que não utilize de processos de eliminação do ferro. Outras situações fisiopatológicas importantes se devem à diminuição do nível de folatos, que promove um quadro hematológico em sangue periférico similar ao da anemia megaloblástica, e as lesões ósseas determinam a presença de deformidades do crânio, maxilar e face, baixa estatura e a presença de massas extra-ósseas, ou metaplasias mielóides, com formações tumorais no mediastino e retroperitônio, ou acentuada esplenomegalia e hepatomegalia.

   Finalmente, o aumento da bilirrubina indireta, especialmente na talassemia beta maior, produz a excreção de dipirróis pela urina e litíase biliar.

   As figuras 7.16, 7.17 e 7.18 mostram de forma esquemática a seqüência dos eventos fisiopatológicos.

   O primeiro relato científico da talassemia beta homozigota foi realizado por um pediatra americano, o Dr. Thomas B. Cooley, que juntamente com sua colega Pearl Lee descreveu, em 1925, os achados hematológicos e clínicos efetuados em quatro crianças que apresentavam anemia grave com aumento do baço e deformidades dos ossos da face e do crânio. Destacaram um fato importante: as crianças tinham origem ancestral da região do mar Mediterrâneo, por serem de descendências italiana e grega. A partir desse relato, essa síndrome foi denominada por anemia de Cooley & Lee, mas constantemente referida apenas como anemia de Cooley. Alguns anos depois, devido à alta prevalência de relatos similares, principalmente na Itália e na Grécia, e também no Líbano, Tunísia, Argélia etc., esses casos de anemias graves passaram a ser conhecidos como Anemia do Mediterrâneo. Mais tarde, durante o Congresso Internacional de Hematologia de 1940, um grupo de cientistas optou pelo termo talassemia major, onde, em grego, thalassa significa mar, e aima, doença do sangue. A adjetivação da gravidade inicialmente foi caracterizada pela palavra major, que significa maior. Posteriormente, com o aprofundamento dos estudos genéticos, passou-se a conhecer melhor as formas de transmissões hereditárias e os defeitos dos genes, e a forma grave foi denominada de talassemia beta homozigota; a talassemia minor ou menor, de heterozigota; e a talassemia intermédia foi definida por uma classificação muito mais clínica do que genética ou laboratorial.

   A talassemia beta homozigota é, portanto, o resultado do estado homozigoto tanto do tipo b⁺ quanto do tipo b⁰ ou, em casos mais raros, de duplo componente heterozigoto b⁺/b⁰. A ausência ou deficiência acentuada na produção de cadeias beta causa anemia grave devido à hemólise intramedular, bem como no baço. As crianças afetadas pela talassemia beta homozigota padecem de anemia no primeiro ano de vida, a partir do período em que o nível de produção de globina gama decresce, e não há a devida hemoglobinização pela diminuição de síntese de globina beta, enquanto a globina alfa tem sua síntese normal. O resultado do desequilíbrio de síntese se manifesta por efeitos fisiopatológicos já descritos. A figura 7.19 mostra uma representação gráfica das falhas do gene beta relacionados às talassemias menor e maior.

   Muitos dos doentes afetados morrem na infância ou na adolescência, podendo, entretanto, alcançar a terceira década, conforme a atenção médica e terapêutica recebidas. Destaca-se, porém, que as principais causas de óbito são infecções ou insuficiências cardíacas, devido à deposição de ferro no miocárdio. O acúmulo de ferro é decorrente da extensa e prematura destruição dos eritrócitos, tanto daqueles que são continuamente produzidos para suprir a anemia hemolítica, quanto dos recebidos em transfusões sanguíneas freqüentes e necessárias, bem como da absorção gastrointestinal aumentada do ferro recebido pela dieta alimentar.

   O padrão de hemoglobinas nos pacientes com talassemia beta homozigota é variável, caracterizando-se pelo aumento de Hb Fetal, com concentrações que variam de 20 a 90%. A Hb A₂ pode estar normal ou elevada e a Hb A aparece somente nos casos de deficiência parcial da síntese de cadeias beta. As crianças que não recebem tratamento adequado desenvolvem o quadro clínico típico da talassemia beta maior, que inclui, além da anemia grave, deformidades ósseas devidas à hiperplasia medular, hepatoesplenomegalia, pigmentação marrom da pele, distúrbios cardíacos e endócrinos, atraso no crescimento e na maturação sexual, infecções recorrentes e deficiência de ácido fólico. Por isso, para garantir a sobrevida dos pacientes, é necessário o tratamento contínuo que consiste em transfusões sanguíneas regulares, que mantêm um nível de hemoglobina adequado e diminue a atividade da medula óssea, e no uso de quelantes do ferro, que auxiliam a eliminação do excesso desse metal no organismo. As tabelas 7.4 e 7.5 resumem as principais características laboratoriais que são comuns em pacientes com talassemia beta homozigota ou maior.

Talassemia beta homozigota (menor)

   O estado heterozigoto da talassemia beta é caracterizado geneticamente pela herança de um único componente alterado (figura 7.19). Nas formas b⁰ e b⁺, a redução da taxa de síntese da globina beta é menor, mas o suficiente para causar discreto grau de anemia microcítica e hipocrômica com aumento de resistência osmótica dos glóbulos vermelhos. São indistinguíveis por exames laboratoriais de rotina (tabela 7.3), entretanto, com a utilização de técnicas de síntese de cadeias ou de biologia molecular com sondas específicas de DNA, podem-se diferenciar esses heterozigotos.

Muitas vezes, a doença é mal diagnosticada e os pacientes são tratados inadequadamente, como se apresentassem anemia por deficiência de ferro. Laboratorialmente, as formas de talassemia b⁰ ou b⁺ caracterizam-se pelo aumento de Hb A (fig.7.20) cuja concentração varia de 4 a 7%, alterações morfológicas dos eritrócitos identificados especialmente por microcitose e hipocromia com muitos esquisócitos, dacriócitos e pontilhados basófilos (fig. 7.21), resistência osmótica aumentada na solução de NaCl a 0,36%, diminuição da hemoglobina corpuscular média (HCM) e do volume corpuscular médio (VCM). A Hb Fetal pode estar normal ou discretamente aumentada. As manifestações clínicas, quando presentes, variam entre os diferentes grupos raciais, e entre elas podemos citar astenia, cansaço e baço palpável. A artrite também pode ser constatada na talassemia beta heterozigota. Os níveis de ácido fólico e vitamina B12 plasmáticas apresentam-se dentro dos limites normais em talassêmicos beta heterozigotos.

De uma forma geral, a maioria dos portadores de talassemia beta, heterozigota apresentam padrões hematológicos que são coincidentes em 90% dos casos descritos na literatura:
VCM: (61 a 73) fl
HCM: (20 a 24) pg
Hb A2: (4 a 7)%
Formas atípicas de talassemia beta heterozigota podem ocorrer, das quais os principais tipos são os seguintes:

Tipo 1 – talassemia beta heterozigota, com Hb A₂ aumentada, VCM e HCM normais.
Tipo 2 – talassemia beta heterozigota, com Hb A₂ diminuída, Hb Fetal discretamente elevada, VCM e HCM diminuídas. Esses casos são suspeitos de talassemia heterozigota beta-delta.
Tipo 3 – talassemia beta heterozigota, com Hb A₂ normal e VCM e HCM diminuídos. Esses casos são suspeitos da associação entre talassemia alfa e beta heterozigotas.

Talassemia intermediária

   As formas clínicas denominadas por talassemia intermédia são aquelas resultantes de diferentes interações genéticas, cujos portadores apresentam quadro clínico mais ameno do que o da talassemia beta maior e não são dependentes de transfusão sanguínea. A talassemia beta intermédia pode decorrer da interação das talassemias alfa e beta, com redução concomitante e significativa de ambas as cadeias globínicas, o que diminui o número de cadeias desemparelhadas e propicia uma redução na taxa de destruição dos eritrócitos em comparação com as formas graves de talassemias. Entretanto a forma mais prevalente de talassemia beta intermédia se deve a lesões do tipo b⁺ ( b⁺/ b⁺), cujo diagnóstico laboratorial somente é feito por biologia molecular. A talassemia beta intermédia pode decorrer também de manifestações da talassemia beta com alguns tipos de hemoglobinas variantes, particularmente a Hb E, Hb S e Hb C.

Associação entre talassemias beta e beta-delta

   A heterozigose dupla para talassemias beta e beta-delta com Hb Fetal elevada é mais freqüente na Grécia. Os portadores dessa forma de talassemia têm anemia de gravidade intermediária, geralmente compensada sem transfusões. Entretanto, os sinais clínicos e a manifestação da anemia variam consideravelmente, e alguns pacientes podem ter hepatoesplenomegalia, anemia e osteoporose. Os pacientes padecem, ainda de predisposição à anemia hemolítica auto-imune. Os resultados hematológicos são similares àqueles encontrados na talassemia beta homozigota, com graves alterações eritrocitárias, diminuição da HCM e da fragilidades osmótica, corpos de inclusão são compostos por agregados de cadeias alfa livre, alta concentração de Hb Fetal (50 a 90%) e Hb A₂ normal ou diminuída (figura 7.23). A distribuição da Hb Fetal intracelular é geralmente homogênea. O diagnóstico é confirmado por exames nos pais, um deles é heterozigoto para talassemia beta e outro para variante beta-delta com Hb Fetal elevada.

Talassemia delta

   Desde que a Hb A₂ representa somente uma menor fração da hemoglobina total, o desequilíbrio da síntese de cadeia delta não tem efeito significativo na morfologia dos glóbulos vermelhos e não tem importância clínica, a menos que esteja associada com outra hemoglobina anormal. Na talassemia delta heterozigota espera-se uma diminuição da Hb A₂, enquanto nos homozigotos esta fração está totalmente ausente.

Persistência hereditária de Hb Fetal

   A persistência hereditária da hemoglobina Fetal (PHHF) é um termo que abrange uma variedade de condições, todas associadas com a produção persistente de Hb Fetal após o período neonatal, com ausência de anormalidades hematológicas importantes. É incluída no capítulo das talassemias beta devido ao fato de o gene beta estar parcial ou totalmente bloqueado para a síntese de globina beta. Entretanto, na PHHF essa ação deletérea é compensada pela contínua síntese de Hb Fetal.

   A classificação da PHHF pode ser resumida em dois grupos básicos: 1) o tipo Negro, e 2) o tipo Grego, que são formas mais freqüentes com distribuição homogênea de Hb Fetal intra-eritrocitária, e o tipo raro em que a persistência da Hb Fetal apresenta-se com distribuição heterogênea.

   A associação entre PHHF e hemoglobinas variantes tem sido descrita notadamente em portadores de Hb S (Hb SF) e Hb C (Hb CF).

   Nos portadores de PHHF/Hb S a falcização não ocorre facilmente, pois a Hb Fetal exerce em cada célula, uma ação protetiva contra a desoxigenação. Clinicamente os portadores dessa interação possuem eritrócitos com características falcizantes diferentes entre si (fato inverso ao que ocorre na anemia falciforme) e, dessa forma, os pacientes não têm infartos recorrentes e se tornam clinicamente parecidos com os portadores de Hb AS.

   A associação entre PHHF e talassemia beta heterozigota provoca alta concentração de Hb Fetal associada com microcitose devido à talassemia. Nesse caso, o diagnóstico laboratorial torna-se difícil e confuso, por apresentar algumas características da talassemia beta homozigota. Entretanto, a condição clínica moderada, juntamente com o estudo familiar, auxilia na diferenciação entre essa forma de interação e a talassemia beta homozigota.

Biologia Molecular

   As talassemias beta constituem um grupo de alterações genéticas da síntese de hemoglobina extremamente diverso e que resulta na diminuição da globina beta. Clinicamente há grande variabilidade com relação a sintomas e manifestações, e essas condições são resultantes de fatores genéticos e adquiridos. A variabilidade clínica e hematológica sugere heterogeneidade genética, que é confirmada atualmente pela grande gama de mutações e alterações gênicas que originam as talassemias beta e cuja classificação pode ser realizada por análise de DNA. O complexo gênico das cadeias do tipo beta compreende uma extensão de aproximadamente 50Kb, incluindo os cinco genes funcionais e o pseudogene, e estão arranjados na seqüência 5’-3’, na mesma ordem em que são ativadas durante as fases do desenvolvimento humano (ver figura 3.5 do capítulo 3 ‘Hemoglobinopatias” – Síntese Genética, deste site).

   Mais de cem pontos de mutação causando talassemia beta foram bem caracterizados, resultando num déficit de cadeias beta que varia de mínima (alelo beta mais) à ausência completa (alelo beta zero). Heterozigotos, incluindo os portadores de alelos beta mais e beta zero, são clinicamente assintomáticos, ao passo que os homozigotos ou portadores de componentes heterozigotos associados apresentam sintomas evidentes, acompanhados de quadros hematológicos muito alterados e são dependentes de transfusão. Variações de ordens clínica e hematológica são observadas, conforme a origem racial do portador.

   Grande parte das talassemias beta é determinada por mutações que afetam um pequeno número de pares de bases e interferem na transcrição, processamento, transporte, estabilidade e tradução do RNAm, ocorrendo também casos de variantes de cadeias polipeptídicas, dentre as quais podemos citar:

   A) Mutações que afetam a transcrição – concentram-se na substituição de nucleotídeos no “TATA box” e nas seqüências CACACC distal e proximal, todos n região promotora 5’ do gene beta. Estão geralmente associadas a fenótipos moderados com início de transcrição reduzido. Variações étnicas dos fenótipos são observadas, sendo provavelmente influenciadas pela presença ou ausência de um nucleotídeo na região promotora. Amplificação gênica por PCR pode ser útil não só para o diagnóstico das talassemias, mas também para estudos de expressão gênica em nível transcricional, pois fornece taxas de RNAm específico 10 vezes maior do que o normal.

   B) Mutantes que alteram o RNAm – as mutações que afetam a estabilidade do RNAm podem estar tanto em alterações no capuz da extremidade 5’, como na região de clivagem do RNAm e no sinal de poliadenilação AATAA da extremidade 3’. As mudanças no capuz que alteram o primeiro resíduo, afetam a função do RNAm reduzindo a transcrição e retardando o processo de formação do capuz, alterado dessa forma a estabilidade do RNAm. Do mesmo modo, mutações na extremidade 3’, reduzem acentuadamente a clivagem do RNAm, produzindo moléculas mais longas e instáveis. Metodologias para determinação das taxas de RNAm fornecem novas e simplificadas formas de diagnóstico para as síndromes talassêmicas e avaliação da expresso gênica em nível transcricional.

   C) Mutações que afetam a tradução – a talassemia beta pode ser também originada por mutações sem sentido, que formam códons de terminalização na região codificadora interrompendo a tradução, e por mutações de sentido errôneo, originando códons para aminoácidos alternativos, como por exemplo, as Hb beta-Indianápolis e beta-Showa-Yakishyi, com alterações nos aminoácidos 112 e 110, respectivamente. Essas cadeias são degradadas logo após sua síntese, devido à sua grande instabilidade, acarretando um estado muito similar ao produzido por redução de cadeias beta. Sete, dos 91 alelos, afetam a tradução do RNAm da globina, sendo tanto em relação às seqüências sem sentido, que determinam a tradução, como em inserções, deleções e mutações “de novo”.

   D) Deleções produzindo talassemia beta – um grande número de deleções afetando o gene beta da globina tem sido observado; muitas envolvendo os genes delta e beta simultaneamente, com alguns casos de PHHF e talassemia delta-beta. A deleção mais comum remove 619 pares de bases do íntron 2, do éxon 3 e da seqüência 3, do gene beta. Outras possuem particular interesse, porque deixam o gene beta intacto com expressão silenciosa, mas são formas muito raras de serem identificadas.

Análise da Talassemia Beta por técnicas moleculares do DNA

   Vários têm sido os métodos utilizados o diagnóstico das hemoglobinopatias pela análise do DNA, quer seja para a caracterização da mutação presente quer seja para o diagnóstico pré-natal.

   O diagnóstico pré-natal das talassemias do tipo beta, alguns anos atrás, era possível através da amostra de sangue fetal colhida in útero, ou de células do líquido amniótico, sendo que este método apresentava alguns sérios inconvenientes, ou seja:

   - A coleta era realizada somente a partir da 17ª semana da amenorréia, o que resultava, quando aconselhada, a interrupção da gravidez numa fase delicada e psicologicamente danosa para a mãe.

   - A coleta e sua análise não poderiam ser realizadas, a não ser em grandes centros especializados pois, com efeito, o diagnóstico pré-natal das talassemias do tipo beta repousava sobre a evidência de uma variação, quantitativa da síntese da cadeia beta globina.Isso exigia uma amostragem de pureza absoluta e análise do sangue fetal por eletroforese de focalização isoelétrica das hemoglobinas, além do estudo dos reticulócitos fetais para sintetizar in vitro, na presença de leucina triciada, cadeias de hemoglobinas.

   A partir de 1982, foi possível realizar este diagnóstico pela análise do DNA de material trofoblástico colhidos entre a oitava e a 12ª semana da amenorréia, o que permitia, quando necessário, a interrupção da gravidez num estado precoce. Uma simples eletroforese desse material permitia reconhecer os casais de risco, mas, infelizmente, esse tipo de análise não informava com precisão a natureza do defeito molecular responsável pela doença, sendo que a maioria das mutações beta talassêmicas permaneceu por muito tempo inacessível por um diagnóstico direto, pois a utilização de oligonucleotídeos era possível unicamente em raros centros de estudo piloto. Por outro lado, as lesões moleculares que alteravam um sítio de restrição ou as grandes deleções facilmente detectáveis não eram comuns. Todavia, os genes beta talassêmicos podiam ser indiretamente evidenciados pela análise das ligações genéticas através dos marcadores RFLPs (polimorfismo dos diferentes fragmentos de DNA obtidos através de restrição enzimática) da região que contém os genes da globina da família beta. Mas, essa técnica dificulta o diagnóstico, pois ela impõe um completo estudo familiar algumas vezes impossível. Além disso, a necessidade de testar um grande número de enzimas de restrição, de utilizar diferentes e diversas sondas, com o propósito de evidenciar os RFLPs informativos, desestimulou consideravelmente este tipo de análise.

   Assim, outros tipos de análises foram sendo testados com o intuito de se determinar a distribuição das mutações nos diferentes grupos étnicos. Isso permitiu, com o tempo, a aplicação de uma estratégia para o diagnóstico que evidenciasse a mutação em questão, sendo que as principais conclusões desses estudos foi o desenvolvimento e a introdução de uma metodologia muito promissora, a PCR (“polymerase chain reaction”), que consiste na amplificação seletiva de um fragmento de DNA, permitindo obter-se uma multiplicação exponencial de uma seqüência do DNA escolhida no meio da qual se encontra a mutação. O princípio do método consiste em utilizar dois oligonucleotídeos, construídos artificialmente, e que sejam complementares às extremidades escolhidas de uma determinada região onde ocorre a mutação, ou com seqüência normal; e uma polimerase, a Taq polimerase. Após a amplificação, a mutação pode ser caracterizada por uma das técnicas atualmente em uso e na dependência das condições laboratoriais de cada centro de pesquisa. A ampliação permite igualmente determinar diretamente a seqüência do DNA amplificado e o sítio de uma mutação.

Através destes estudos chegou-se às seguintes conclusões:

   1. Foram catalogadas, até o momento, mais de 100 diferentes mutações do gene beta globina, sendo a grande maioria representada por mutações pontuais.

   2. Existe, próprio de cada grupo étnico, um pequeno número de alelos específicos responsáveis por aproximadamente 90% das mutsações talassêmicas, ou seja:
   a) nas populações da região mediterrânea: códon sem sentido 39 (C ® T) IVSI nt 110 (G ® A), IVSI nt 6 (T ® C), IVSI nt 1 (G ® A) e IVSII nt 745 (C ® G). Dois destes defeitos moleculares são responsáveis por perto de 60% dentre estas mutações, a b⁰ e a b⁺ 110 que presominam respectivamente a leste e a oeste da bacia do Mediterrâneo;
   b) nas populações da Índia e do Paquistão: IVSI nt 5 (G ® G), deleção de 619 pares de bases, “frameshift” 8-9, IVSI nt 1 (G ® T) e “grameshift” 41-42;
   c) nas populações chinesas e do sudeste da Ásia: “grameshift” 41-42, IVSI nt 654 (C ® T), códon sem sentido 17 (A ® T) e -28 (A ® G);
   d) entre os negros americanos: -29 (A ® G), -88 (G ® T) e códon 24 (T ® A).

   3. O Norte da África (Argélia e Tunísia) constitui um caso particular, pois os cinco defeitos moleculares mais freqüentes no Mediterrâneo representam menos do que 50% das mutações. Além do mais, existe uma grande heterogeneidade molecular e várias mutações foram caracterizadas neste grupo étnico (IVSI nt 1 G ® C, IVSI nt T ® G, IVSI nt 2 T ® C, IVSI nt 5 G ® A e IVSI nt 843 C ® A).

   Desse modo, num primeiro plano, as mutações a pesquisar são funções da etnia do paciente e da natureza da talassemia, seja b⁰ ou seja b⁺. Esta pesquisa, atualmente, é realizada após amplificação do gene beta; seja por digestão do produto da amplificação com determinadas enzimas de restrição; seja por hibridização com oligonucleotídeo alelo específico (ASO ou Dot Blot). Todavia, estas técnicas não são totalmente satisfatórias, pois a origem étnica dos pacientes, principalmente no Brasil, é muito variada, sendo necessário dispor de um grande número de oligonucleotídeos alelo específicos o que para alguns laboratórios é muito difícil devido aos altos custos. Este fator torna-se trabalhoso quando não se conhecem as mutações da etnia que se está analisando.

   A seqüência direta do produto amplificado pode ser uma boa alternativa, mas este método é de realização delicada e por conseqüência não é atualmente aplicável à rotina de um grande número de amostra.

   Torna-se portanto indispensável um método simples, rápido, preferencialmente que não utilize material radioativo para a sua identificação e adaptável ao caráter de urgência que caracteriza o diagnóstico pré-natal. Uma metodologia que promete se tornar de grande valia, no que se refere a estes aspectos, é a análise por eletroforese em gradientes de desnaturação (DGGE) do produto de amplificação do gene beta globina e que permite colocar em evidência a maioria das mutações beta talassêmicas, sem prejulgar a sua natureza e a sua posição, mas podendo ser comparada aos perfis de mutações conhecidas.

Análise das mutações do gene beta por DGGE

   Numa primeira etapa escolhe-se o segmento de DNA a analisar, como por exemplo, através de um programa informatizado de algoritmos que permite conhecer a carta de fusão do fragmento de DNA que corresponde à totalidade do gene beta globina desde a região do promotor até o sinal de poliadenilação. A partir desta carta de fusão, é possível definir a posição e a seqüência de dois “primers” complementares (oligonucleotídeos construídos artificialmente) e que serão colocados para amplificardas partes escolhidas do gene beta globina. Esta amplificação com ajuda dos “primers” deve preencher três critérios de seleção:

   1. Seu tamanho deve estar compreendido entre 500 e 1.000 pares de bases, sendo melhor analisar 500 ou menos pares de bases, pois a qualidade da resolução da eletroforese diminui quando fragmentos maiores são analisados.

   2. Cada um deles deve conter, ao menos, dois domínios de fusão de estabilidade diferentes, permitindo que a posição final do gel destes diferentes fragmentos dependa exclusivamente da temperatura de fusão do domínio menos estável.

   3. Cada parte do gene beta globina a pesquisar corresponde ao menos uma vez ao domínio estável do fragmento dado, sendo que isto permite analisar a totalidade do gene beta, e colocar em evidência a maioria das mutações responsáveis pelas talassemias do tipo beta.

   Os “primers” que apresentam um só domínio de fusão e, portanto, se desnaturando em bloco numa determinada concentração de desnaturante, não permitem evidenciar as modificações do comportamento fusional ligado às variações das seqüências nucleotídicas, podem ser acrescidos de seqüências ricas em G e C (“GC-clamps”) adicionadas em 5’ de um dos “primers”, criando artificialmente um domínio de alta estabilidade não-desnaturável nas condições da eletroforese, resultando com isso que cada um desses fragmentos possua, agora, dois domínios de fusão de estabilidades diferentes.

   Desse modo, pode-se ter vários fragmentos e utiliza-los de acordo com uma estratégia específica para a pesquisa das mutações mais freqüentes encontradas na dependência de etnia que se queira analisar.

   Calcula-se que o DNA apresenta, em média, um polimorfismo para cada 500 pares de bases, sendo que estes polimorfismos, algumas vezes, transformam-se em excelentes marcadores para análises genéticas. Centenas deles foram mapeadas, em intervalos mais ou menos regulares, no genoma humano.

   No gene beta globina, em especial, foram mapeadas cinco posições específicas definindo quatro seqüências diferentes de nucleotídeos consideradas normais e que foram denominadas de “frameworks”, ou conformação, ou estruturas, 1, 2, 3 e 3a, estas posições compreendem o último nucleotídeo do códon 2 e os nucleotídeos 16, 74, 81 e 666 do íntron II.

   Os “frameworks” 1 e 2 diferem por um nucleotídeo na posição 74 do IVSII, sendo isso observado em todas as populações analisadas até o momento.

      O “framework” 3 pode ser considerado como específico de populações mediterrâneas, sendo que possui cinco diferentes nucleotídeos com relação ao “framework” 1. Por sua vez, o “framework” 3a pode também ser observado em todas as populações, com exceção da população mediterrânea, sendo que difere em quatro posições em relação ao “framework” 1, e em apenas uma posição em relação ao “framework” 3.

Diagnóstico laboratorial das talassemias beta

Diferentemente do doente com talassemia beta homozigota (ou maior), que padece de anemia grave e outras situações clínicas, o portador da talassemia beta heterozigota (ou menor) é quase sempre assintomático e fisiologicamente adaptado a essa situação. Assim, se há alguma dificuldade em se estabelecer o diagnóstico laboratorial com segurança, certamente esta situação ocorre entre os heterozigotos.

   As características hematológicas dos portadores são idênticas nas diversas variedades de talassemia menor, sendo todos dependentes da redução da síntese de hemoglobina. De forma geral, algumas características são comuns a 90% dos talassêmicos heterozigotos:

   - concentração de hemoglobina discretamente inferior ao valor normal para a correspondente faixa etária e sexo;
   - aumento (compensatório) do número de eritrócitos, geralmente acima de 5,0 x 10⁶/mn’, que não corresponde ao volume eritrocitário (hematócrito), pois o empacotamento é composto por eritrócitos microcíticos e hipocrômicos;
   - redução do volume corpuscular médio (VCM) pela não-correspondência entre os valores eritrocitários altos para hematócritos diminuídos; e redução da hemoglobina corpuscular média (HCM) pela escassa hemoglobinização;
   - aumento da resistência globular osmótica, em solução de NaCl a 0,36%, devido à reduzida hemoglobinização e à leptocitose dos eritrócitos;
   - alterações morfológicas dos eritrócitos, caracterizados principalmente por microcitose, hipocromia, esquizócitos, dacriócitos, leptócitos e pontilhados basófilos.

   Portanto, para identificar a talassemia beta heterozigota há necessidade de análises específicas que distinguimos em três níveis (tabela 7.5).

Primeiro Nível

Segundo Nível

   Análise de hemoglobina com técnicas específicas: a aplicação da técnica de eletroforese por isoeletrofocalização ocorre em casos muito específicos, com o objetivo de separar hemoglobinas variantes com fenótipos talassêmicos. O melhor exemplo da aplicação dessa técnica se refere à Hb Knossos, uma hemoglobina estruturalmente anormal, que ao se associar à talassemia beta heterozigota provoca a redução na síntese de RNAm para a globina beta. Essa hemoglobina variante não se evidencia por meio de técnicas comuns de eletroforese, necessitando da isoeletrofocalização. Entre as técnicas específicas incluem pesquisa de corpos de Heinz e raramente síntese de globina.



Terceiro Nível

   Análise do DNA: o estudo do DNA é realizado por tecnologia molecular e tem sido aplicado no diagnóstico de talassemias que apresentam dificuldade de identificação pelas técnicas descritas nos primeiro e segundo níveis. É usada com muita frequência, também para estabelecer os pontos de mutações que ocorrem no complexo gênico beta, permitindo, dessa forma, a diferenciação molecular de diversos genótipos de talassemia beta.