Técnicas Laboratorias de Identificação de Hemoglobinas Normais e Variantes

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Técnicas Laboratorias de Identificação de Hemoglobinas Normais e Variantes

Preparação de Soluções de Hemoglobinas (Hemolisados)

Autor: Paulo Cesar Naoum 
Introdução

Os hemolisados para eletroforese de hemoglobinas podem ser feitos por meio do uso de saponina a 1% (100m l de sangue total e 100m l de saponina) ou pelo tratamento com clorofórmio. O uso de clorofórmio destrói a Hb H e Hb Instáveis, porém é usado para a dosagem de Hb Fetal.

Preparação do hemolisado com clorofórmio – a obtenção de hemolisado entre 10 e 15g/dL de hemoglobina, tal qual o método descrito a seguir, é importante para dosagem de Hb Fetal. Para eletroforese qualitativa de hemoglobinas é aconselhável usar hemolisados com concentrações de hemoglobina variáveis entre 4 a 6g/dL. A técnica de preparação de hemolisados consiste das seguintes fases:

1. Centrifugar 1ml de sangue com anticoagulante a 1.500rpm, durante 5 minutos; remover o plasma e lavar os eritrócitos por duas a três vezes com solução salina a 0,85%. Centrifugar outra vez nas mesmas condições e desprezar o sobrenadante.
2. Ao volume de eritrócitos lavados, adicionar outro de água destilada. Homogeneizar, e a seguir adicionar um volume de clorofórmio, idêntico ao do hemolisado formado. Agitar vigorosamente e centrifugar a 2.000rpm, por 15 minutos.
A solução de hemoglobina sobrenadante, ou hemolisado, é retirada por meio de pipeta Pasteur e transferida para um frasco limpo. A concentração do hemolisado, preparado conforme metodologia apresentada, geralmente é variável entre 10 e 15g/dL.

Preparação de hemolisados rápidos – esse procedimento técnico é recomendável para estudo populacional, nas suspeitas de hemoglobinas instáveis e talassemia alfa. Não é aconselhável utilizá-lo para dosagens bioquímicas de hemoglobinas, especialmente de Hb Fetal.

Reativo hemolisante

Saponina P.A. ………………….. 1g
Água destilada …………………. 100ml

Procedimento

a) para amostras de sangue com hematócrito acima de 40%, misturar 1 volume de sangue com 2 volumes de reativo hemolisante;
b) para amostras de sangue com hematócrito entre 30 e 40%, misturar 1 volume de sangue com 1 volume de reativo hemolisante;
c) para amostras de sangue com hematócrito abaixo de 30%, misturar 2 volumes de sangue com 1 volume de reativo hemolisante.

A homogeneização deve se processar até a hemólise completa da mistura. Utilizar o hemolisado após 5 minutos, e no máximo 24 horas depois da sua preparação.

1- Eletroforese Quantitativa em Acetato de Celulose pH 8,0 – 9,0

Princípio

Em pH 8,0 – 9,0 a hemoglobina é uma proteína carregada negativamente, migrando em direção ao pólo positivo. Esse método identifica as hemoglobinas normais e grande parte das variantes. As diferentes mobilidades verificadas entre as diversas hemoglobinas com defeitos estruturais se devem às alterações de cargas elétricas, causadas por substituições de aminoácidos de diferentes pontos isoelétricos (pI). As hemoglobinas que não envolvem alterações de cargas elétricas, geralmente apresentam mobilidade eletroforética semelhante à da Hb A; nesse grupo situa-se a maioria das hemoglobinas instáveis.

Equipamento

1. Cuba de eletroforese
2. Tiras de acetato de celulose
3. Papel absorvente
4. Aplicador de amostras

Reagentes

1. solução tampão: Tris-EDTA-borato 0,025M pH 8,5 (TEB pH 8,5)
Tris-hidroximetil-aminometano……………………….10,2g
Ácido etileno-diamino-tetracético…………………… 0,6g
Ácido bórico………………………………………………… 3,2g
Água destilada q.s.p…………………………………..1000ml

Procedimento

1. Colocar igual quantidade de solução tampão em cada compartimento eletrolítico da cuba de eletroforese;
2. Embeber o acetato de celulose na solução tampão, previamente colocada numa vasilha, pelo menos durante 15 minutos;
3. Enxugar o acetato de celulose entre duas folhas de papel absorvente para remover o excesso de solução tampão;
4. Ajustar as tiras de acetato de celulose na cuba de eletroforese, deixando-as esticadas, utilizando-se de perfex ou papel de filtro para fazer a ponte de corrente elétrica na fita;
5. Aplicar as amostras nas tiras de acetato de celulose (hemolisado com saponina 1%, ou solução de hemoglobina) a 2 cm do compartimento do pólo negativo;
6. Passar 300 volts por 20 minutos;
7. Analisar o fracionamento, durante os 5 primeiros minutos, observando a presença ou não de Hb H. A Hb H, quando presente, somente é possível de ser visualizada em hemolisados feitos com saponina a 1%.

Controle

Durante a eletroforese é importante o uso de, pelo menos, uma amostra controle. Na ausência de padrões tipo Hb AS, Hb AC, ou outra forma de hemoglobina variante, usa-se uma amostra com hemoglobina normal. O padrão normal constitui-se num excelente meio de comparação entre hemoglobinas “normais” e “anormais”. A utilização de “mapas” de referência é muito útil na interpretação dos resultados. Consulte o capítulo 5 (Listagem das hemoglobinas variantes) deste site.

Precauções

Para o uso de qualquer eletroforese são fundamentais os seguintes cuidados:
1. Verificar se as luvas de mãos, a cuba de eletroforese, as tiras de acetato, o aplicador e o papel absorvente estão limpos;
2. Observar se a solução tampão não está contaminada por colônias de fungos;
3. A solução tampão, usada continuamente, é suficiente para oito a dez procedimentos seguidos. Porém, no uso esporádico, por exemplo, uma vez por semana, é interessante conservar a cuba com tampão na geladeira;
4. A obtenção de fracionamento deficiente pode ser causada por:
a) solução tampão deteriorada;
b) alteração do pH do tampão;
c) alta molaridade do tampão;
d) corrente elétrica deficiente;
e) má qualidade do acetato de celulose;
f) excesso ou deficiência da amostra aplicada.

2- Dosagem de Hb A2 por Eletroforese de Acetato de Celulose pH 8,0 – 9,0

Utilizam-se os mesmos equipamentos, reagentes, e procedimentos da técnica anterior.

Procedimento específico

a) Aplicar 20m l da solução de hemoglobina, numa única tira de acetato de celulose, com 4,5 a 5,5 cm de largura. Para acetato de celulose com 2,5 cm de largura usar duas tiras, depositando 10m l em cada uma delas;
b) Passar 300 volts durante 20 minutos;
c) Após o fracionamento, as hemoglobinas A e A2, são recortadas com tesoura, e eluídas em tubos contendo água destilada, na quantidade de 3 ml (para a Hb A2) e 9 ml (para a Hb A). Deixar a eluição se processar por 2 horas à temperatura ambiente, homogeneizando por inversão os tubos a cada 15 minutos. Nas eluições superiores a 2 horas, conservar o material sob refrigeração.
d) Usar água destilada como branco, e fazer a leitura em espectrofotômetro, a 410 nm;
e) Cálculo:

 

% Hb A2= DO A2 X 100
______________
DO A X 3 + DO A2

VR: 2,0 à 4,0%

3- Eletroforese em Ágar pH 6,2

Princípio

O emprego da eletroforese em ágar pH 6,2 é específico para diferenciar alguns tipos de hemoglobinas mais lentas do que a Hb A, quais sejam: Hb S da Hb D e Hb C da Hb E, que migram em posições similares em eletroforeses alcalinas. Por essa técnica as hemoglbinas S e C separam-se da Hb A, enquanto as hemoglobinas D e E migram nas mesma posição da hemoglobina A. Esse sistema de fracionamento propicia, também, a quantificação de Hb Fetal.

Equipamento

1. cuba de eletroforese e fonte geradora de voltagem
2. papel de filtro
3. aplicador de amostra (lamínula ou lâmina de barbear)
4. erlenmayer de 200 a 250 ml
5. lâmina de microscópio
6. pipetas de 10 ml

Reagentes

1. solução tampão fosfato pH 6,2
Na2HPO4 …………………………………………………….. 2,02g
NaH2PO4 . H2O …………………………………………….. 0,6g
Água destilada q.s.p……………………………………….1000ml
Esta solução será usada nos compartimentos eletrolíticos bem com na preparação do gel de agar.
2. bacto-ágar (Difco Lab.)

Procedimento

1. colocar no erlenmayer 200mg de agar e dissolve-los em 20ml do tampão fosfato, levando-o ao fogo e agitando-o rotatoriamente a cada 10 minutos, até a completa dissolução do agar;
2. pipetar 3,5ml do gel liquefeito em cada lâmina. Esse procedimento dever ser realizado cuidadosamente: coloca-se a pipeta verticalmente na porção média da lâmina, e deixa-se que o gel se escoe lentamente por toda a extensão da lâmina, até completar o volume 3,5ml, deixar por 10 a 15 minutos em repouso;
3. aplicar as amostras (solução de hemoglobina, ou hemolisado com saponina) na porção média da lâmina. Para isso usa-se pedaço de lamínula, ou de lâmina de barbear (tipo Gillette), molhado em sua extremidade com a amostra a ser analisada. A aplicação se faz introduzindo verticalmente o aplicador no gel, observando-se o cuidado de não atingir a lâmina;
4. colocar a lâmina na cuba de eletroforese, e conectar suas extremidades com os respectivos compartimentos eletrolíticos por meio de “pontes” realizadas com duplo papel de filtro;
5. passar 100 a 150 volts por 20 a 15 minutos, respectivamente;
6. analisar o fracionamento, inicialmente sem corar;
7. remover a lâmina e corar com Ponceau S (ou outro corante de proteínas) por 20 minutos;
8. descorar com ácido acético a 5%.

Observação: É possível comprar géis prontos para este procedimento sob o nome de agarose ácida para eletroforese de hemoglobinas.

4- Dosagem Bioquímica de Hb Fetal

Princípio

A Hb Fetal é mais resistente à desnaturação por soluções fortemente alcalinas do que outros tipos de hemoglobinas. O teste é realizado adicionando-se uma determinada quantidade de solução alcalina em uma concentração conhecida de hemolisado preparado de eritrócitos lavados e tratados com água e clorofórmio. Após um tempo específico, a desnaturação é bloqueada por adição de sulfato de amônio saturado, ou parcialmente saturado. O sulfato de amônio diminui o pH e precipita a hemoglobina saturada. Após a filtração, a quantidade de hemoglobina inalterada é avaliada e expressa como hemoglobina álcali-resistente (ou Hb Fetal) em valores percentuais.

Equipamento

1. espectrofotômetro
2. pipetas de 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml
3. cronômetro
4. papel de filtro
5. tubos 17 X 100 mm
6. funis pequenos

Reagentes

1. Solução de Drabkin (cianeto)
K3Fe(Cn)6……………………………….200mg
KCN………………………………………200mg
Água destilada q.s.p………………..1000ml

2. NaOH 1,2N
NaOH…………………………………..48g
Água destilada q.s.p………………1000ml

3. Solução saturada de sulfato de amônio
(NH4)2SO4…………………………….500g
Água destilada q.s.p………………500ml

Procedimento

1. Diluir 0,6 ml da solução de hemoglobina em um tubo contendo 10 ml da solução de Drabkin. Homogeneizar bem por inversão.
2. Colocar 5,6 ml da solução de hemoglobina diluída no item 1 em um tubo rotulado “Hb Fetal”. Adicionar 0,4 ml da solução NaOH 1,2 N e acionar o cronômetro. Agitar cuidadosamente por 10 segundos.
3. Ao final de dois minutos exatos, adicionar 4 ml da solução saturada de sulfato de amônio. Homogeneizar por inversão e deixar em repouso por 5 a 10 minutos no máximo.
4. Filtrar o conteúdo do tubo “Hb Fetal” em papel de filtro duplo.
5. Preparar a solução padrão, colocando em um tubo de ensaio: 1,4 ml da solução de hemoglobina diluída no item 1, 0,1 ml de água destilada e 1 ml da solução saturada de sulfato de amônio. Homogeneizar e transferir 1 ml dessa solução para outro tubo, e juntar 9 ml de solução Drabkin. A solução padrão é 10 vezes mais diluída do que a solução de “Hb Fetal”.
6. Ler a DO do tubo “Hb Fetal” e do padrão em 540 nm, utilizando-se como branco a solução de Drabkin.
7. Cálculo:

 

% Hb Fetal = DO Hb Fetal X 100
_______________
DO padrão X 10

VR: 0,0 à 2,0% para adultos normais

5- Teste de Precipitação para Hemoglobinas Instáveis

Princípio

As cadeias da hemoglobina (e o tetrâmero) são estruturas altamente estáveis, e dependem da força coletiva de quatro fatores:
1. um grande conteúdo helicóide que constitui 75% da estrutura de cada cadeia polipeptídica;
2. o firme ligamento entre o grupo heme e o polipeptídeo (globina);
3. a localização interna de aminoácidos não-polares e hidrofóbicos, que mantêm o “pacote” de proteção ao grupo heme;
4. os contatos a1b1 que estabilizam a integração entre as cadeias alfa e beta.

A diminuição da estabilidade da hemoglobina pode ser resultante da alteração de qualquer um dos quatro fatores, geralmente sensíveis quando expostos ao calor.
Em um tampão apropriado, a hemoglobina normal é dificilmente precipitada quando submetida à determinada temperatura (50 a 60°C); por um certo tempo de exposição sob as mesmas condições, as hemoglobinas instáveis se desnaturam e se precipitam.
Apresentaremos dois testes específicos para detectar hemoglobinas instáveis: a) desnaturação ao calor e b) precipitação por isopropanol.

A) TESTE DE DESNATURAÇÃO AO CALOR

Equipamento

1. tubos de vidro 17 x 100mm e 12 x 75mm
2. pipetas de 5ml
3. centrífuga
4. banho-maria: 50 a 60°C
5. pH metro
6. balão volumétrico de 100ml

Reagentes

1. Solução fosfato monobásico de sódio 0,1M
NaH2PO4 . H2O……………………….13,8g
Água destilada q.s.p………………..1 litro
2. Solução de hidrogenofosfato de di-sódio 0,1M
Na2HPO4 (anidro)………………….14,2g
Água destilada q.s.p………………1 litro

3. Solução tampão fosfato, pH 7,4:
Solução de NaH2PO4 0,1M……19,2ml
Solução de Na2HPO4 0,1M…… 80,8ml

4. NaCl a 0,8%

Procedimento

1. em um tubo de hemólise colocar 1ml de sangue fresco, coletado com anticoagulante. Centrifugar a 1.500rpm e desprezar o plasma. Lavar os eritrócitos com NaCl a 0,85%, por duas vezes. Hemolisar os eritrócitos com 5ml de água destilada. Homogeneizar por seis vezes;
2. transferir o hemolisado para um tubo maior e, adicionar 5ml do tampão fosfato (pH 7,4), homogeneizar por seis vezes e centrifugar por 10 minutos a 1.500rpm;
3. transferir 2ml do sobrenadante para outro tubo e incuba-lo a 50°C, em banho-maria, por uma hora, ou a 60°C por trinta minutos;
4. observar se houve precipitação.

Controle

É fundamental o uso de uma amostra controle, obtida nas mesmas condições da amostra teste.

Interpretação

Em sangue com hemoglobinas normais é possível que ocorra discreto grau de precipitação. O resultado é positivo quando a precipitação é floculenta e em grande quantidade.

Precauções

1. as amostras a serem analisadas não devem exceder 72 horas após a coleta;
2. o diagnóstico da Hb instável deve ser confirmado por outros testes específicos: corpos de Heinz, eletroforese de hemoglobina, dosagem de metaemoglobina;
3. a temperatura e o pH 7,4 do tampão são pontos críticos nesse teste.

B) TESTE DE PRECIPITAÇÃO POR ISOPROPANOL

Equipamento

1. tubos de vidro 17 x 75mm e rolha
2. pipeta de 5ml
3. micropipeta de 100m l
4. banho-maria: 37°C
5. centrífuga
6. pH metro

Reagentes

1. Solução tampão Tris/isopropanol pH 7,4
Tris-hidroximetril-aminometano.12,11g
Isopropanol puro ………………….. 170ml
Água destilada q.s.p…………………1 litro
Ajustar o pH 7,4 com HCl concentrado

Procedimento

1. colocar 100m l de sangue + 100m l de saponina a 1% em um tubo de hemólise. Agitar moderadamente até que se processe a hemólise;
2. adicionar ao hemolisado, 2ml de tampão Tris/isopropanol previamente equilibrado a 37°C. Agitar moderadamente, ou homogeneizar por inversão, e incubar essa solução por uma hora a 37°C;
3. observar, a cada 10 minutos, se houve precipitação.

Interpretação

A presença de Hb instável causa floculação nos primeiros 10 minutos, seguida de precipitação.

Precauções

1. as hemoglobinas normais permanecem estáveis durante todo o processo. Entretanto, pode ocorrer discreta precipitação em alguns casos, após 30-45 minutos. A Hb S é mais instável que a Hb A. A Hb A2 é a hemoglobina mais estável entre as hemoglobinas humanas;
2. é necessário o uso de uma amostra controle, obtida nas mesmas condições que o teste;
3. a temperatura de 37°C, o pH 7,4 do tampão e a concentração de isopropanol são pontos críticos neste teste;
4. o diagnóstico de Hb instável deve ser confirmado por outros testes específicos: corpos de Heinz, eletroforese de hemoglobina, dosagem de metaemoglobina.

6- Dosagem de Metaemoglobina por Absorção Espectrofotométrica

Princípio

A metaemoglobina é um subproduto resultante da transformação da oxiemoglobina. Essa transformação é decorrente da contínua oxidação da hemoglobina que ocorre notadamente devido ao envelhecimento e conseqüente apoptose do eritrócito. Entretanto outros fatores podem influenciar no aumento da concentração de metaemoglobina, por ex.: Hb S (AS, SS, SC, SF), talassemias beta maior e menor, Hb instáveis, Hb M, oxidações induzidas pela deficiência de G-6PD, e oxidações “adquiridas” de medicamentos (ex.: sulfas, nitritos, Tc), alimentos, meio ambiente poluído (ex.: gases de NOx e SOx).

Reagentes

1 – Solução estoque de Tampão Fosfato M/15
Na2HPO412H2O ……………………………… 9,0g
KH2PO4 …………………………………………. 5,7g
H2O q.s.p. ……………………………………… 1,0 litro

2 – Solução trabalho de Tampão Fosfato M/60
Diluir 250 ml da solução estoque para 1 litro (q.s.p.) de água destilada.
Obs.: Conservar as soluções estoque e trabalho em refrigerador.

3 – Saponina a 1%.

Procedimento

Para cada análise usar dois tubos de hemólise identificados por A e B.
Tubo A: Colocar primeiramente 100m l de sangue total, coletado com anticoagulante e adicionar 100m l de saponina. Agitar para ocorrer hemólise. A seguir, adicionar 6 ml do tampão Fosfato M/60. Homogeneizar por inversão.
Tubo B: Colocar 300m l da mistura do tubo A e, a seguir, 3 ml do tampão Fosfato M/60. Homogeneizar por inversão.

Leituras espectrofotométricas

a) Ajustar o espectrofotômetro em comprimento de onda 630 nm, usar o tampão Fosfato M/60 como branco e acerto do zero da absorbância, e a seguir fazer a leitura do tubo A, anotando o valor da densidade óptica (D.O.).
b) Ajustar o espectrofotômetro em comprimento de onda 540 nm, usar o tampão Fosfato M/60 como branco e acerto do zero da absorbância, e a seguir fazer a leitura do tubo B, anotando o valor da densidade óptica (D.O.).

Cálculo:

 

% DE Meta Hb = D.O. 630 nm X 100
___________________________
D.O. 630 nm + (D.O. 540 nm X 10)

Obs.: O coeficiente 10 se deve à diluição realizada no tubo B (300m l do tubo A: 3 ml do tampão Fosfato).

Interpretação

A leitura do tubo A em 630 nm avalia a absorbância da metaemoglobina obtida da hemólise dos eritrócitos e diluída em solução tamponada. Por outro lado, a leitura B, sob as mesmas condições, em 540 nm avalia a absorbância da oxiemoglobina. Para obter sensibilidade técnica na leitura, a solução do tubo B foi diluída dez vezes.

Valores normais – Os valores normais para concentração de metaemoglobina variam de 0 a 4%. Acima de 4% se considera elevada.

7- Pesquisa Intra-Eritrocitária de Hb H

Princípio

A Hb H é uma hemoglobina anormal cuja molécula é formada somente por globinas beta, sendo portanto um tetrâmero b4, diferente da Hb A que é composta por um tetrâmero constituído por duas globinas alfa e duas globinas beta – a2b2.
A Hb H se deve à diminuição de globinas alfa que ocorre na talassemia alfa, por isso as globinas beta se juntam e se tetramerizam.
Uma das formas de identificar a talassemia alfa é pesquisar a presença de Hb H nos eritrócitos. Para pesquisa-la é necessário induzir sua precipitação com o corante azul de crezil brilhante.

Reagentes

Corante de Azul de Crezil Brilhante
Azul de crezil brilhante……………………………….. 1,0g
Citrato de sódio ………………………………………… 0,4g
Cloreto de sódio ……………………………………….. 0,8g
H2O q.s.p. ……………………………………………….. 100ml

Procedimento

1) Colocar em um tubo de hemólise 100m l de sangue total com anticoagulante (EDTA, heparina, sequestrene ou ACD) e adicionar 200m l do corante Azul de Crezil Brilhante. Misturar com leve agitação.
2) Incubar em banho maria a 37ºC por 30 a 40 minutos.
3) Após incubação fazer o esfregaço tradicional e pesquisar a presença de eritrócitos com Hb H na porção fina da lâmina.
4) A presença de uma ou mais células típicas de Hb H é indicativo da talassemia alfa.

IMPORTÂNCIA

A talassemia alfa se deve a lesão parcial ou total de um, dois, três ou dos quatro genes alfa. Dessa forma, observa-se que sua manifestação clínica e laboratorial é muito heterogênea.
A forma mais comum em todo o mundo é a lesão de apenas um gene. Neste caso é difícil encontrar a Hb H precipitada nos eritrócitos, e na eletroforese a fração de Hb H está abaixo de 1%. O paciente não tem anemia devido a este tipo de talassemia alfa. A sua prevalência no Brasil varia de 10 a 20%.
A lesão de dois genes alfa causa maior precipitação de Hb H nos eritrócitos, é comum vê-los em todos os campos microscópicos, e na eletroforese de hemoglobina a fração de Hb H tem concentração entre 1 a 5%. Sua prevalência em nossa população é cerca de 3 a 6%, e causa discreto grau de anemia microcítica e hipocrômica.
Na lesão de três genes, as manifestações clínicas são evidentes pela anemia e esplenomegalia, enquanto as alterações laboratoriais apresentam anemia microcítica e hipocrômica de grau moderado (Hb: 9 a 10,0g/dl). Na eletroforese a Hb H tem concentrações acima de 5% (> 5% a 25%), e a pesquisa intraeritrocitária apresenta inúmeros eritrócitos com precipitados de Hb H. A freqüência de tal. alfa com lesão de três genes alfa (ou doença de Hb H) é de 1:5.000 pessoas. Por fim, a lesão de quatro genes alfa quando parciais podem causar a doença de Hb H, mas quando as lesões são totais, fato que não sintetiza nenhuma globina alfa, o portador padece de hidropsia fetal, com morte fetal ou logo ao nascer, 100% dos seus eritrócitos tem precipitados de Hb Bart’s (similar à Hb H). No Brasil há pouquíssimos casos relatados. É comum nas populações do sudeste asiático.
Informações mais completas poderão ser encontradas no capítulo 7 deste site.

8- Teste para Avalias a Fragilidade Osmótica dos Eritrócitos

Princípio

Todos eritrócitos normais e anormais apresentam equilíbrio osmótico em soluções isotônicas de cloreto de sódio (NaCl) com concentração entre 0,8 e 0,9%. Contudo, há eritrócitos com defeitos na constituição protética da membrana que se comportam com mais fragilidade osmótica em relação aos eritrócitos normais. Esses eritrócitos mais frágeis hemolisam intensamente, a partir de soluções de NaCl com concentrações decrescentes: 0,6%, 0,5%, 0,4% e 0,3%. Para conhecer o grau de hemólise se faz a medida da fragilidade osmótica eritrocitária, bem como a curva de fragilidade osmótica.

Reativos

1) Solução estoque de NaCl a 10%
NaCl …………………………….. 9,00gr
Na2HPO4 ………………………. 1,36gr
NaH2PO4H2O ………………….0,27gr
H2O q.s.p. ………………………100ml

2) Soluções de NaCl com concentrações decrescentes de 0,9 a 0,1%.
A preparação dessas soluções se faz a partir da solução estoque de NaCl a 10%, conforme as seguintes diluições com água em balão volumétrico de 100ml.

Soluções de NaCl Solução de NaCl a 10% Adição H2O destilada
0,9 9 ml + 91 ml
0,8 8 ml + 92 ml
0,7 7 ml + 93 ml
0,6 6 ml + 94 ml
0,5 5 ml + 95 ml
0,4 4 ml + 96 ml
0,3 3 ml + 97 ml
0,2 2 ml + 98 ml
0,1 1 ml + 99 ml

Procedimento

Sempre que for realizar o teste de fragilidade osmótica num paciente é necessário compará-lo com outra amostra “normal”, com sangue coletado nas mesmas condições (mesmo anticoagulante, mesmo dia).
Para cada tubo de hemólise identificado com a devida concentração de NaCl e os nomes dos analisados, proceder da seguinte forma:

1) 5ml de cada solução de NaCl (0,9 a 0,1%)
50m l de sangue bem homogeneizado
2) Homogeneizar os tubos por inversão (3 a 5 vezes), e deixá-los em repouso por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente (± 25ºC).
3) Centrifugar todos os tubos por 5 minutos em 1500 a 2000 rpm.
4) Após a centrifugação transferir, por meio de pipeta Pasteur, o sobrenadante de cada tubo para outro correspondente devidamente identificado com as concentrações de NaCl e os nomes dos analisados.
5) Proceder a leitura espectrofotométrica de todos os sobrenadantes, em comprimento de onda 540nm (ou filtro verde), da seguinte forma:

a) Usar o sobrenadante do tubo com NaCl 0,9% de cada amostra analisada como branco (acerto do zero).
b) A partir do acerto do zero na escala de absorbância ou densidade óptica (D.O.), fazer a leitura de cada tubo. O valor da D.O. do sobrenadante do tubo com NaCl 0,1% corresponderá a 100% de hemólise, e a partir desse valor se calculará por meio de regra de três as hemólises de outros tubos.
c)

Ex:
DO NaCl 0,1% —— 100%
DO NaCl 0,2% —— X

X = DO NaCl 0,2% x 100
________________
DO NaCl 0,1%

 

% NaCl % Lise Normal % Lise na esferocitose
0,1 100 100
0,2 99 — 100 100
0,3 90 — 100 100
0,4 50 — 90 90 — 100
0,5 0 — 6 20 — 80
0,6 0 0 — 10
0,7 0 0
0,8 0 0

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